Nacida en el siglo XVI como Isabel Flores de Oliva, fue hija de Gaspar Flores, arcabucero natural de Baños de Montemayor, municipio de la provincia de Cáceres (España). Así lo asegura la placa en la casa de los Flores, la cual aún se conserva en dicho pueblo cacereño. En 1545, Gaspar salió de España, después de pasar por Puerto Rico y Panamá, que formaban parte del virreinato de Nueva España, llegó al Perú en 1547, como soldado del Pacificador Pedro de la Gasca, quien restableció la Real Audiencia en 1549, recuperando el dominio de la Corona tras la usurpación del poder por Gonzalo Pizarro, gobernante del Perú entre 1544-1548. Gaspar Flores fue nombrado arcabucero el 9 de marzo de 1557, por don Andrés Hurtado de Mendoza, tercer virrey del Perú entre 1556-1561. El 1 de mayo de 1577, se casó, en Lima, con la criolla limeña María de Oliva y Herrera, apellidos procedentes de Aragón. Ese mismo año servía de arcabucero en la guarda del V Virrey Francisco de Toledo (1569-1581).
La tradición y algunos cronistas señalan que Isabel Flores Oliva nació en una aldea llamada La Puntillá, en la isla de Taboga (enPanamá)[cita requerida] —Esta información fue refutada en el "proceso de canonización", publicado en los archivos del Vaticano—. Después de su nacimiento, la familia partió de la isla para establecerse en la ciudad de Lima.
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Regresó a Lima con su familia ya siendo una joven. Debido a problemas económicos de la familia, trabajaba el día entero en el huerto y solía bordar con gran esmero para diferentes familias de la ciudad y así ayudar al sostenimiento de su hogar.
A pesar de todo, se encontraba conforme con su forma de vida y no hubiera tratado de cambiarla si no hubiera sido por la insistencia de sus padres en casarla. Rosa resistió durante más de diez años y finalmente hizo voto de virginidad ante la imagen del "doctorcito" para confirmar su resolución. Al cabo de unos años ingresó en la Tercera orden de Santo Domingo a imitación de santa Catalina de Siena.
A partir de entonces se recluyó prácticamente en la ermita que ella misma construyó, con ayuda de su hermano Hernando, en un extremo del huerto de su casa. Sólo salía para visitar el templo de Nuestra Señora del Rosario y atender las necesidades espirituales de los indígenas y los negros de la ciudad. También atendía a muchos enfermos que se acercaban a su casa buscando ayuda y atención, creando una especie de enfermería en su casa. Muchos biógrafos escriben que ayudaba a fray Martín de Porres, lo cual no está probado en el texto del "Proceso de Martín de Porres" (Lima 1579-1639), el cual es santo desde 1962.